Barnabé, cujo nome original era José, era um levita natural da ilha de Chipre. Ele se destaca nos primeiros capítulos de Atos como um membro respeitado e generoso da igreja de Jerusalém. Foi ele quem vendeu um campo que possuía e trouxe todo o dinheiro aos pés dos apóstolos (Atos 4:36-37). Impressionados com seu caráter encorajador, os apóstolos lhe deram o apelido de Barnabé, que significa "Filho da Consolação" ou "Filho da Exortação" (Atos 4:36).
Seu papel como encorajador e "construtor de pontes" foi crucial na vida do apóstolo Paulo. Quando Saulo (Paulo), o antigo perseguidor, se converteu e tentou se juntar aos discípulos em Jerusalém, estes estavam receosos e desconfiados. Foi Barnabé quem tomou Saulo sob sua proteção, acreditou em sua história, o levou aos apóstolos e testemunhou sobre sua conversão e pregação corajosa em Damasco (Atos 9:26-27).
Mais tarde, quando o evangelho começou a se espalhar entre os gentios na igreja de Antioquia da Síria, a igreja de Jerusalém enviou Barnabé para investigar. Ao chegar lá, "vendo a graça de Deus, alegrou-se e exortava a todos a que, com firmeza de coração, permanecessem no Senhor. Porque era homem bom, cheio do Espírito Santo e de fé". Seu ministério ali foi frutífero, e "muita gente se uniu ao Senhor" (Atos 11:22-24). Reconhecendo a necessidade de mais ensino e a capacidade de Saulo, Barnabé foi a Tarso procurá-lo e o trouxe para Antioquia, onde ensinaram juntos naquela igreja vibrante e mista por um ano inteiro (Atos 11:25-26).
Barnabé e Saulo também foram encarregados pela igreja de Antioquia de levar uma coleta para ajudar os irmãos na Judeia durante uma fome (Atos 11:27-30). Ao retornarem a Antioquia, trouxeram consigo João Marcos, primo de Barnabé (Atos 12:25; Colossenses 4:10).
Impulsionados pelo Espírito Santo e comissionados pela igreja de Antioquia com imposição de mãos, Barnabé e Saulo (agora cada vez mais conhecido como Paulo) embarcaram na Primeira Viagem Missionária (c. 46-48 d.C.). Iniciaram em Chipre, terra natal de Barnabé, onde confrontaram o mágico Elimas e viram a conversão do procônsul Sérgio Paulo. Continuaram pela Ásia Menor (Panfília e Galácia), pregando em sinagogas e a gentios, enfrentando tanto grande sucesso quanto forte oposição (Atos 13-14). É notável que, no início da viagem, Lucas nomeia "Barnabé e Saulo", mas gradualmente a ordem muda para "Paulo e Barnabé", indicando a crescente proeminência de Paulo. João Marcos os acompanhou inicialmente, mas os deixou na Panfília.
Após a viagem, surgiu em Antioquia a controvérsia sobre se os gentios convertidos precisavam ser circuncidados e guardar a Lei Mosaica. Barnabé e Paulo foram enviados a Jerusalém para discutir a questão com os apóstolos e presbíteros no Concílio de Jerusalém (c. 49 d.C.). Lá, eles relataram os "sinais e prodígios que Deus fizera por meio deles entre os gentios", e sua perspectiva foi fundamental para a decisão do concílio de não impor o jugo da Lei aos gentios (Atos 15:1-12; Gálatas 2:1-10). Paulo menciona em Gálatas 2:9 que Tiago, Pedro e João, as "colunas", reconheceram a graça dada a ele e a Barnabé e lhes deram a destra de comunhão.
No entanto, um incidente posterior em Antioquia (Gálatas 2:11-14) mostrou uma fraqueza momentânea. Quando certos homens vieram da parte de Tiago, Pedro começou a se afastar dos gentios com quem antes comia, por medo dos judaizantes. Paulo relata que "também os demais judeus dissimularam com ele, a ponto de o próprio Barnabé ter-se deixado levar pela dissimulação deles". Paulo repreendeu Pedro publicamente por essa hipocrisia.
Antes de iniciar a Segunda Viagem Missionária, surgiu um "desacordo agudo" entre Paulo e Barnabé. Barnabé queria levar seu primo João Marcos novamente, mas Paulo recusou, pois Marcos os havia abandonado na viagem anterior. A divergência foi tão forte que eles se separaram. Barnabé tomou consigo João Marcos e navegou para Chipre, sua terra natal (Atos 15:36-41). Paulo escolheu Silas e seguiu por outro caminho.
Depois disso, Barnabé desaparece da narrativa de Atos. Paulo, porém, o menciona posteriormente em 1 Coríntios 9:6, perguntando: "Ou somente eu e Barnabé não temos direito de deixar de trabalhar [para nos sustentar]?", indicando que Barnabé continuava ativo no ministério e, talvez como Paulo, às vezes abria mão do sustento financeiro das igrejas. Tradições posteriores falam de seu ministério contínuo em Chipre e possível martírio lá, mas carecem de confirmação bíblica.