Mateus, também chamado de Levi, filho de Alfeu, era um publicano, ou seja, um coletor de impostos judeu a serviço das autoridades (provavelmente Herodes Antipas na Galileia, sob supervisão romana). Esta profissão era amplamente desprezada por seus compatriotas, pois envolvia colaboração com o poder opressor romano e era frequentemente associada à extorsão e desonestidade. Ele estava exercendo sua função em Cafarnaum, sentado na coletoria (posto de coleta de impostos, *telōnion*), quando Jesus passou por ali (Mateus 9:9; Marcos 2:14; Lucas 5:27).
Jesus dirigiu-lhe um chamado simples e direto: "Segue-me". A resposta de Mateus/Levi foi imediata e radical: "Ele, levantando-se, o seguiu" (Mateus 9:9), "deixando tudo, levantou-se e o seguia" (Lucas 5:28). Este ato de abandonar uma profissão lucrativa (embora malvista) para seguir um mestre itinerante demonstra o poder transformador do chamado de Cristo.
Logo após seu chamado, Mateus/Levi ofereceu um grande banquete em sua casa para Jesus e seus discípulos. Ele convidou também "numerosa multidão de publicanos e outros" (Lucas 5:29), provavelmente seus antigos colegas de profissão e outras pessoas consideradas "pecadoras" pela elite religiosa. Este ato de hospitalidade e inclusão provocou a crítica dos fariseus e escribas, que questionaram os discípulos (e Jesus) por comerem e beberem com tais pessoas. Jesus respondeu defendendo sua missão: "Os sãos não precisam de médico, e sim os doentes. Eu não vim chamar justos, e sim pecadores, ao arrependimento" (Lucas 5:31-32), citando também Oséias 6:6 em Mateus 9:13: "Misericórdia quero e não holocaustos".
Posteriormente, Mateus foi formalmente incluído na lista dos Doze Apóstolos escolhidos por Jesus (Mateus 10:3; Marcos 3:18; Lucas 6:15; Atos 1:13). Seu próprio evangelho o identifica na lista como "Mateus, o publicano", talvez um lembrete humilde de sua origem ou um testemunho da graça de Jesus que o chamou.
Embora o Novo Testamento não forneça mais detalhes sobre seu ministério apostólico individual após o Pentecostes, a tradição cristã primitiva, a começar por Papias de Hierápolis (citado por Eusébio no século IV), atribui a ele a autoria do primeiro Evangelho canônico. Papias menciona que Mateus "compilou os *logia* [ditos ou oráculos] em dialeto hebraico [ou aramaico], e cada um os interpretou [ou traduziu] como pôde". Embora o Evangelho de Mateus que temos hoje esteja em grego e seja mais do que apenas uma coleção de ditos, esta tradição aponta para Mateus como a fonte apostólica por trás deste evangelho, que tem um forte sabor judaico, enfatizando Jesus como o Messias Rei, o Filho de Davi, que cumpre as profecias do Antigo Testamento, e contém grandes blocos de ensinamentos de Jesus, como o Sermão da Montanha.
Tradições posteriores sobre o ministério de Mateus variam, sugerindo que ele pregou primeiro aos judeus na Judeia e depois viajou para outras nações como Etiópia, Pérsia ou Pártia. Relatos sobre sua morte também divergem, com algumas tradições falando de martírio e outras de morte natural.