Nicodemos era um Fariseu e um "principal entre os judeus" (João 3:1), o que indica que ele era um membro do Sinédrio, o supremo conselho religioso e judicial judaico em Jerusalém. Sua primeira aparição ocorre em João 3, quando ele procura Jesus "de noite", talvez por medo de seus colegas líderes religiosos, por cautela, ou simplesmente para ter uma conversa particular e aprofundada.
Ele inicia o diálogo reconhecendo Jesus como "Mestre vindo da parte de Deus", por causa dos sinais miraculosos que Jesus realizava (João 3:2). Jesus imediatamente o confronta com a necessidade espiritual fundamental: "Em verdade, em verdade te digo que, se alguém não nascer de novo [ou 'do alto'], não pode ver o reino de Deus" (João 3:3). Nicodemos, inicialmente, interpreta isso de forma literal e demonstra dificuldade em compreender o conceito espiritual ("Como pode um homem nascer, sendo velho?"). Jesus então elabora, explicando que é necessário nascer "da água e do Espírito" para entrar no Reino, contrastando o nascimento físico com o espiritual (João 3:4-8). Jesus expressa surpresa que Nicodemos, sendo "mestre em Israel", não compreendesse essas verdades espirituais, e prossegue com um discurso sobre Sua própria missão (ser levantado como a serpente no deserto), o amor redentor de Deus que enviou Seu Filho, a necessidade da fé para a salvação, e a natureza do julgamento como a rejeição da Luz (João 3:9-21), incluindo o famoso versículo João 3:16.
Nicodemos reaparece em João 7:45-52. Durante a Festa dos Tabernáculos, havia grande debate sobre Jesus, e os principais sacerdotes e fariseus enviaram guardas para prendê-lo, mas estes voltaram sem sucesso, impressionados com Suas palavras. Em meio à frustração e desprezo dos líderes ("Porventura, algum dos principais creu nele? Ou algum dos fariseus?"), Nicodemos (identificado como "aquele que anteriormente viera ter com Jesus") intervém cautelosamente, apelando para a própria lei deles: "A nossa lei, porventura, julga um homem sem primeiro ouvi-lo e saber o que ele faz?". Sua tentativa de defender um processo justo é rapidamente rebatida com escárnio por seus colegas, que o acusam de ser também da Galileia (de onde acreditavam que nenhum profeta viria).
Sua terceira e última aparição é a mais ousada e pública, ocorrendo após a crucificação de Jesus (João 19:38-42). Enquanto José de Arimateia (outro discípulo secreto por medo dos judeus) pediu a Pilatos o corpo de Jesus, Nicodemos o acompanhou, trazendo "cerca de cem libras [aproximadamente 34 kg] de um composto de mirra e aloés". Esta era uma quantidade enorme e muito cara de especiarias, normalmente usada para o sepultamento de reis ou pessoas muito ricas, indicando a grande honra que Nicodemos agora prestava abertamente a Jesus, mesmo em Sua morte vergonhosa. Juntos, Nicodemos e José de Arimateia envolveram o corpo de Jesus em lençóis com as especiarias, segundo o costume judaico de sepultamento, e o depositaram no túmulo novo de José.
A trajetória de Nicodemos no Evangelho de João mostra uma progressão notável: do inquiridor noturno e temeroso, passando pelo defensor hesitante da justiça, até o discípulo que publicamente se identifica com Jesus em Seu momento de maior rejeição e humilhação, participando ativa e generosamente de Seu sepultamento. Ele representa aqueles que, mesmo vindo de posições de poder e tradição religiosa estabelecida, são atraídos pela verdade de Cristo e eventualmente demonstram sua fé de forma concreta.