A Serpente aparece no Jardim do Éden em Gênesis 3, logo após a criação de Adão e Eva. Ela é introduzida como "mais astuta que todas as alimárias do campo que o SENHOR Deus tinha feito" (Gênesis 3:1). Sua astúcia se manifesta imediatamente em sua abordagem a Eva.
Ela inicia o diálogo questionando sutilmente a bondade e a palavra de Deus: "É assim que Deus disse: Não comereis de toda árvore do jardim?" (Gênesis 3:1). Eva corrige a pergunta, afirmando que podiam comer de todas as árvores, exceto da Árvore do Conhecimento do Bem e do Mal, sob pena de morte. A Serpente então passa da insinuação para a contradição direta da palavra de Deus e a acusação contra Seu caráter: "É certo que não morrereis. Porque Deus sabe que no dia em que dele comerdes se vos abrirão os olhos e, como Deus, sereis conhecedores do bem e do mal" (Gênesis 3:4-5). Ela planta a semente da dúvida, do desejo por autonomia e da desconfiança em relação a Deus, apelando para o orgulho e o desejo de ser "como Deus".
Eva cede à tentação – vendo que a árvore era boa para comer, agradável aos olhos e desejável para dar entendimento – comeu do fruto proibido e o ofereceu a Adão, que também comeu (Gênesis 3:6). Este ato de desobediência, instigado pela Serpente, constitui a Queda da humanidade, resultando na perda da inocência (perceberam que estavam nus), na vergonha, no medo de Deus e na quebra da comunhão original com o Criador (Gênesis 3:7-10).
Quando Deus confronta Adão e Eva, eles tentam culpar outros – Adão culpa Eva (e indiretamente Deus, que a deu a ele), e Eva culpa a Serpente ("A serpente me enganou, e eu comi" - Gênesis 3:13). Deus então pronuncia juízos sobre cada um deles. À Serpente, Deus dirige uma maldição específica: "Porquanto fizeste isso, maldita serás mais que toda besta e mais que todos os animais do campo; sobre o teu ventre andarás e pó comerás todos os dias da tua vida" (Gênesis 3:14). Além da humilhação física, Deus estabelece uma inimizade espiritual perpétua: "Porei inimizade entre ti e a mulher, entre a tua descendência e o seu descendente. Este te ferirá a cabeça, e tu lhe ferirás o calcanhar" (Gênesis 3:15). Esta última frase é conhecida como o Protoevangelho (a primeira promessa do evangelho), prevendo o conflito contínuo entre a humanidade (representada pela descendência da mulher, culminando em Cristo) e as forças do mal (representadas pela serpente e sua descendência), e a vitória final de Cristo sobre Satanás (ferir a cabeça), embora Ele mesmo fosse ferido no processo (ferir o calcanhar).
Embora Gênesis 3 não identifique explicitamente a Serpente com Satanás, essa conexão é feita claramente no Novo Testamento. Apocalipse 12:9 e 20:2 se referem ao "grande dragão", que é "a antiga serpente, que se chama Diabo e Satanás, o sedutor de todo o mundo". Paulo também alude ao evento, temendo que os coríntios sejam enganados "como a serpente enganou a Eva com a sua astúcia" (2 Coríntios 11:3). Jesus identifica o Diabo como "homicida desde o princípio" e "pai da mentira" (João 8:44), características evidentes na ação da Serpente no Éden. Assim, a Serpente de Gênesis é entendida como a manifestação ou o instrumento do próprio Satanás na primeira tentação humana, responsável por introduzir o pecado e a morte na criação de Deus.