Timóteo era um jovem discípulo da cidade de Listra, na região da Licaônia (Ásia Menor). Sua mãe, Eunice, era uma judia crente, e sua avó, Lóide, também possuía uma fé sincera. Seu pai, no entanto, era grego (Atos 16:1; 2 Timóteo 1:5). Desde a infância, Timóteo foi instruído nas Sagradas Escrituras (o Antigo Testamento) por sua mãe e avó (2 Timóteo 3:15).
Quando Paulo visitou Listra em sua Segunda Viagem Missionária (c. 49-50 d.C.), ouviu o bom testemunho que os irmãos de Listra e Icônio davam de Timóteo. Paulo desejou que Timóteo o acompanhasse na missão. Devido à sua ascendência judaica por parte de mãe, e para evitar obstáculos desnecessários no ministério entre os judeus, Paulo circuncidou Timóteo antes de partirem (Atos 16:1-3).
A partir daí, Timóteo tornou-se um dos companheiros mais constantes, leais e confiáveis de Paulo, referido pelo apóstolo com grande afeição como "meu verdadeiro filho na fé" (1 Timóteo 1:2) e "meu filho amado e fiel no Senhor" (1 Coríntios 4:17). Ele viajou extensivamente com Paulo, participando da evangelização na Macedônia (Filipos?, Tessalônica, Bereia) e Acaia (Corinto) na Segunda Viagem, e esteve com Paulo em Éfeso durante a Terceira Viagem (Atos 16-20).
A confiança de Paulo em Timóteo era tal que ele frequentemente o enviava como seu representante pessoal para lidar com situações delicadas nas igrejas. Foi enviado de Atenas a Tessalônica para fortalecer a fé dos recém-convertidos em meio à perseguição (1 Tessalonicenses 3:1-6). Foi enviado de Éfeso a Corinto para lembrar os crentes dos caminhos de Paulo em Cristo e lidar com problemas na igreja (1 Coríntios 4:17; 16:10-11), embora talvez sua natureza mais tímida ou jovem tenha dificultado essa missão específica. Paulo o elogia imensamente aos Filipenses, dizendo não ter "ninguém igual a ele" em genuíno interesse pelo bem-estar deles, planejando enviá-lo em breve (Filipenses 2:19-24).
Timóteo também é listado como co-remetente em seis das epístolas de Paulo (2 Coríntios, Filipenses, Colossenses, 1 e 2 Tessalonicenses, Filemom), indicando sua estreita colaboração com o apóstolo na obra missionária e na comunicação com as igrejas.
As duas cartas pessoais de Paulo a Timóteo (1 e 2 Timóteo), conhecidas como Epístolas Pastorais, são particularmente importantes. Elas sugerem que Paulo havia encarregado Timóteo de supervisionar a igreja em Éfeso (1 Timóteo 1:3), uma tarefa desafiadora. Nessas cartas, Paulo instrui seu jovem protegido sobre a sã doutrina, as qualificações para bispos/presbíteros e diáconos, a conduta na adoração pública, o cuidado com diferentes grupos na igreja (viúvas, presbíteros), e o combate a falsos mestres. Paulo encoraja Timóteo a não se deixar intimidar por sua juventude (1 Timóteo 4:12), a reavivar o dom que havia recebido (2 Timóteo 1:6), a ser forte na graça, a suportar o sofrimento como bom soldado de Cristo, a manejar bem a palavra da verdade, a fugir das paixões da mocidade e a cumprir plenamente seu ministério (2 Timóteo).
A segunda carta a Timóteo tem um tom particularmente comovente, escrita por Paulo de sua prisão final em Roma, pouco antes de seu martírio. Ele expressa sua solidão ("somente Lucas está comigo") e pede a Timóteo que venha vê-lo rapidamente, trazendo Marcos, sua capa e seus pergaminhos (2 Timóteo 4:9-13, 21).
Hebreus 13:23 menciona que "o irmão Timóteo foi posto em liberdade", sugerindo que Timóteo também pode ter sido preso por sua fé em algum momento. Tradições posteriores da igreja o consideram o primeiro bispo de Éfeso e relatam que ele foi martirizado ali durante um festival pagão, mas essas informações não estão na Bíblia. Timóteo permanece como um modelo de discipulado fiel, serviço dedicado e liderança pastoral na segunda geração da igreja.