Natanael, natural de Caná da Galileia (João 21:2), é introduzido no Evangelho de João (capítulo 1) através de seu amigo Filipe, que também havia acabado de ser chamado por Jesus. Filipe o encontra e anuncia com entusiasmo: "Achamos aquele de quem Moisés escreveu na Lei e a quem se referiram os profetas: Jesus, o Nazareno, filho de José" (João 1:45). A resposta inicial de Natanael foi de ceticismo, possivelmente baseado em preconceito regional contra a insignificante Nazaré: "De Nazaré pode sair alguma coisa boa?" (João 1:46). Filipe sabiamente não argumentou, mas simplesmente o convidou: "Vem e vê".
Ao ver Natanael se aproximando, Jesus fez uma declaração surpreendente sobre seu caráter: "Eis um verdadeiro israelita, em quem não há dolo!" (João 1:47). Intrigado, Natanael perguntou como Jesus o conhecia. Jesus respondeu com conhecimento sobrenatural: "Antes que Filipe te chamasse, eu te vi, quando estavas debaixo da figueira" (João 1:48). O conteúdo exato do que aconteceu sob a figueira não é revelado, mas foi algo significativo e pessoal para Natanael, talvez um momento de oração ou meditação profunda. Essa demonstração da onisciência de Jesus dissipou imediatamente o ceticismo de Natanael.
Sua resposta foi uma das confissões de fé mais rápidas e completas registradas nos Evangelhos: "Rabi, tu és o Filho de Deus, tu és o Rei de Israel!" (João 1:49). Ele reconheceu Jesus não apenas como um mestre (Rabi), mas como o divino Filho de Deus e o esperado Rei messiânico de Israel. Jesus afirmou que Natanael crera por causa do sinal sob a figueira, mas prometeu que ele veria "coisas maiores", incluindo "o céu aberto e os anjos de Deus subindo e descendo sobre o Filho do Homem" (João 1:50-51), uma alusão à escada de Jacó e à revelação da glória divina em Jesus.
Embora o nome Natanael não apareça nas listas dos Doze Apóstolos nos Evangelhos Sinóticos (Mateus, Marcos, Lucas) e em Atos, o nome Bartolomeu aparece nessas listas, frequentemente junto com Filipe (Mateus 10:3; Marcos 3:18; Lucas 6:14; Atos 1:13). Como "Bartolomeu" significa "Filho de Tolmai" (um patronímico, não um nome pessoal) e Natanael some das narrativas onde Bartolomeu aparece, a maioria dos estudiosos e a tradição da igreja concluem que Natanael e Bartolomeu são a mesma pessoa, sendo Natanael seu nome próprio e Bartolomeu seu sobrenome ou nome familiar.
Após seu chamado e inclusão entre os Doze, Natanael/Bartolomeu testemunhou o ministério, os milagres, a morte e a ressurreição de Jesus. Ele é mencionado especificamente como estando presente com outros seis discípulos na aparição de Jesus ressurreto junto ao Mar de Tiberíades (Galileia) em João 21:2.
O Novo Testamento não fornece mais detalhes sobre sua vida ou ministério após o Pentecostes. Tradições posteriores da igreja sugerem que ele pregou o evangelho em vários lugares, incluindo a Índia, Mesopotâmia, Pártia, Licaônia e, mais prominentemente, na Armênia. A tradição também sustenta que ele sofreu o martírio por sua fé, sendo frequentemente descrito como tendo sido esfolado vivo e depois decapitado ou crucificado na Armênia, que o considera seu apóstolo fundador.