João Marcos, geralmente chamado apenas de Marcos no Novo Testamento, era filho de uma mulher chamada Maria, que possuía uma casa grande em Jerusalém onde os primeiros cristãos se reuniam para oração (Atos 12:12). Era também primo de Barnabé (Colossenses 4:10), o que provavelmente facilitou sua entrada inicial no círculo missionário.
Ele aparece pela primeira vez em Atos quando Barnabé e Saulo (Paulo) o levam consigo de Jerusalém de volta para Antioquia após entregarem a ajuda para a fome na Judeia (Atos 12:25). Logo depois, ele parte com Barnabé e Paulo no início da Primeira Viagem Missionária, servindo como seu auxiliar (*hypēretēs*) em Chipre (Atos 13:5). No entanto, ao chegarem a Perge, na Panfília (Ásia Menor), por razões não especificadas, João Marcos decidiu deixá-los e retornar a Jerusalém (Atos 13:13). Essa deserção foi vista com seriedade por Paulo.
Quando Paulo e Barnabé planejavam a Segunda Viagem Missionária, surgiu um "forte desacordo" (*paroxysmos*) entre eles precisamente por causa de Marcos. Barnabé queria dar a seu primo uma segunda chance e levá-lo novamente, mas Paulo se opôs firmemente, considerando que alguém que havia abandonado o trabalho anteriormente não era confiável para a nova jornada. A divergência foi tão intensa que levou à separação da dupla missionária original: Barnabé tomou Marcos consigo e navegou para Chipre, enquanto Paulo escolheu Silas e partiu pela Síria e Cilícia (Atos 15:36-41).
Embora esta separação tenha sido dolorosa, a história de Marcos não termina aí. Anos mais tarde, fica claro que ele foi restaurado à comunhão e ao ministério, ganhando novamente a confiança de Paulo. Durante a primeira prisão de Paulo em Roma (c. 60-62 d.C.), Marcos estava com ele e é incluído nas saudações enviadas aos Colossenses (Colossenses 4:10 – onde Paulo instrui "se ele for ter convosco, recebei-o") e na carta a Filemom (Filemom 1:24), sendo chamado de "cooperador".
De forma ainda mais significativa, perto do fim de sua vida, durante sua última e mais severa prisão em Roma (c. 64-67 d.C.), Paulo pede especificamente a Timóteo: "Toma contigo Marcos e traze-o, pois me é útil para o ministério" (2 Timóteo 4:11). Isso demonstra uma completa reconciliação e uma alta valorização de Marcos por parte do apóstolo.
Além de sua relação com Paulo e Barnabé, Marcos também desenvolveu uma associação muito próxima com o apóstolo Pedro. Em sua primeira epístola, Pedro envia saudações da igreja em "Babilônia" (provavelmente um código para Roma) e inclui "Marcos, meu filho" (1 Pedro 5:13), usando um termo de afeição paternal que indica uma relação espiritual íntima.
Esta conexão com Pedro é fundamental para a tradição mais antiga e consistente da igreja sobre a autoria do segundo Evangelho. Papias, bispo de Hierápolis no início do século II (citado pelo historiador Eusébio), afirmou que Marcos, tendo sido intérprete de Pedro, escreveu acuradamente, embora não em ordem cronológica, tudo o que se lembrava dos ditos e feitos do Senhor conforme ouvira da pregação de Pedro. Assim, o Evangelho de Marcos é tradicionalmente visto como o "Evangelho de Pedro", refletindo o testemunho ocular e a perspectiva do apóstolo líder, registrado por seu fiel companheiro e "filho" espiritual, Marcos.
Tradições posteriores também associam Marcos à fundação da igreja em Alexandria, no Egito, e ao seu martírio ali, mas estas carecem de confirmação bíblica ou histórica primitiva.